摘要

檢測生物制藥產品中可能存在的內毒素對患者安全至關重要。雖然內毒素分子本身是高度穩定的，但基質成分、儲存溫度和容器組成等各種因素都會影響其在制造收集并隨后檢測內毒素含量的樣品時的穩定性。

位于馬薩諸塞州安多弗的輝瑞制藥公司開發了一個程序，用于創建內部天然內毒素（NOE）制劑，以評估內毒素在不同基質、溫度和容器中的穩定性。使用NOE比使用市售的細菌內毒素工作標準品（CSE）更有優勢，如增加實驗室的靈活性和控制，輝瑞公司已使用內部天然內毒素（NOE）制劑來評估內毒素在不同基質和溫度下的穩定性。

介紹

內毒素是一種脂多糖結構，位于革蘭氏陰性細菌的細胞壁中。由于內毒素屬于一類被稱為熱原的致熱物質，因此可能含有內毒素的腸外用藥產品會引起患者的熱原反應。

FDA規定的內毒素限值為5EU/kg體重。超過此含量的內毒素限值可能會導致發燒、休克和死亡。出于安全性和合規性的考慮，在生物制造過程和產品中監測和控制內毒素含量至關重要。

鱟試劑（LAL）檢測法通常用于檢測生物制品中的內毒素含量。檢測貫穿于整個純化過程以及原料藥和成品藥生產過程的各個環節。有效的內毒素檢測對于產品的安全性非常重要。因此，準確檢測產品生產和釋放過程中可能存在的任何內毒素至關重要。

盡管人們普遍認為內毒素分子本身具有高度穩定性，但各種基質、溫度和/或儲存容器都可能影響鱟試劑（LAL）檢測法檢測內毒素存在的能力。在馬薩諸塞州安多弗的輝瑞?？谱o理中心啟動了多項研究來探討這些影響。 為了測量時間和/或溫度對內毒素回收的影響，有必要在起始生物制藥樣品中加入內毒素。由于要對多種基質和溫度進行評估，因此需要大量的內毒素才能完成這些研究。

細菌內毒素工作標準品（CSE）是一種商業上可用的內毒素類型。CSE用于為鱟試劑（LAL）檢測法準備標準曲線和陽性產品對照（PPC）。CSE由獲得許可的鱟試劑供應商從純化的大腸桿菌菌株中制備，并在配方中含有填充劑。因此，CSE并不代表實際污染事件中可能存在的內毒素。此外，CSE通常不適用于高濃度的EU/mL配方。

自然產生的內毒素（NOE）由革蘭氏陰性細菌產生，經過過濾但未經進一步處理，使其成為污染事件的代表性物質。此外，由于它可以培養到非常高的EU/mL濃度，因此適合用于加標研究。

生物體的選擇

對多種革蘭氏陰性生物體進行篩選以產生NOE，以確定用于產生NOE制劑的潛在候選物。所有NOE溶液均通過在胰蛋白酶大豆瓊脂（TSA）上制備草坪培養物并在32°C下孵育24-48小時來制備。從培養皿中取出菌落，接種到胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）中，在32°C的振蕩培養箱中培養過夜。將所得培養物離心，用0.45μm過濾器過濾，并使用動態顯色法鱟試劑檢測內毒素。表1-1列出了所評估的每種生物的EU/mL值。

先前在馬薩諸塞州安多佛的輝瑞公司基地使用大腸桿菌和粘質沙雷氏菌制劑進行的NOE加標研究非常有用，因為它們產生了高濃度的EU/mL儲備溶液，并且在很長一段時間內保持穩定。產生高濃度內毒素的生物體特別適用于加標研究，因為這些制劑可以靈活地測試低和高的加標濃度。

由于這些制劑產生的內毒素濃度遠遠高于常規使用時的水平，因此每次使用前都必須確認實驗室制備的NOE儲存液的濃度，以便制備準確的加標溶液。

LAL驗證與LAL加標研究

在產品生產和發布過程中對LAL檢測進行常規使用驗證時，會將CSE形式的內毒素作為PPC添加到已稀釋的樣品中，以評估基質抑制/增強作用。驗證活動重點關注干擾因素測試，通過確定PPC加標回收率（即，加標到PPC中的內毒素的回收率必須達到 50-200%）來評估樣品基質是否會干擾內毒素檢測。當加標回收率在可接受的PPC加標回收范圍內，并且與USP第<85>章中設定的參數一致時，選擇樣品稀釋。

LAL驗證研究的設計通常會考慮到樣品基質的影響，即樣品稀釋到一定程度后，檢測中不再出現干擾，這是由稀釋樣品中PPC加標回收率決定的。在這種情況下，PPC中的內毒素只有在稀釋后才會與樣品發生作用，而不是在開始時。

為了確定樣品基質對內毒素的影響，在進行常規LAL檢測之前，內毒素必須與未稀釋的樣品基質相互作用。

使用NOE最初加標未稀釋的樣品更能代表污染事件，因為這種污染的來源很可能是細菌來源，而不是來自加工后的內毒素來源（如CSE）。

PPC加標和NOE加標的作用之間的主要區別在于，PPC加標提供有關樣品基質是否干擾檢測本身的檢測措施的信息，而NOE加標提供有關樣品基質與內毒素直接相互作用的信息。圖1說明了使用動力學LAL檢測法進行常規檢測和NOE加標研究之間的區別。

保持時間研究的設計

在許多情況下，LAL樣品運到檢測實驗室后，要放置一段時間才能開始檢測。應進行研究，以評估該保持時間對特定樣品類型內毒素回收的影響。NOE對于這些研究非常有用，因為實驗室可以很容易地制備和儲存高濃度的EU/mL儲存液，從而可以相對簡單地制備出各種內毒素濃度的加標樣品。

在進行LAL檢測之前，通過在未稀釋的樣品中添加NOE來進行保持時間研究。立即對加標樣品進行分析以確定起始濃度，并在設定的時間點儲存和分析等分試樣。通過在未稀釋的樣品中加入NOE，可以在初始時間點以及樣品的儲存時間和溫度下確定產品和基質對可能存在的任何內毒素的影響。在這些研究中使用動力學LAL測定法，因為結果是定量的，可以確定每個時間點的內毒素量。

表1-2顯示了在2-8°C溫度下將兩種不同的緩沖液保持3周時，使用摻入NOE的兩種緩沖液進行保持時間研究的結果，表1-3顯示了在-80°C溫度下，將兩種緩沖液保持3個月時，使用摻入相同兩種緩沖液進行保持時間研究的結果。這些結果表明，無論在何種溫度下，內毒素都可以從緩沖基質中回收。

保持時間研究的一個重要考慮因素是確認最初加入的內毒素量。當NOE加入后直接測定起始時間點時，必須考慮樣品基質是否對內毒素回收率有直接影響。為了證明沒有樣品基質干擾，在無熱原水（LRW） 中進行了相同的加標。表1-4說明了此無熱原水加標確認的使用情況。本研究使用了三種不同的NOE加標水平，由目標NOE加標量表示。測試樣品和無熱原水欄下的實際回收量在LAL測定可變范圍內，且表明不存在樣品基質的干擾。

起始時間點測試和使用NOE進行故障排除

以下研究（表1-5）清楚地說明了在無熱原水中對起始時間點進行加標確認的重要性。將NOE加標到測試樣品中并立即進行測定以確定起始NOE濃度。NOE以三種不同的濃度加標，由目標NOE加標表示。在所有三種加標水平的稀釋度測試中，內毒素回收率均低于檢測限值。然而，由于沒有進行無熱原水確認，因此很難確定是否存在稀釋或測定誤差，或實際的基質或產品干擾。

這項研究以兩種不同的加標水平重復進行，無熱原水確認樣品與測試樣品同時進行（表1-6）。添加無熱原水確認樣品清楚地表明，樣品基質存在干擾，導致檢測樣品中無法檢測到內毒素。

在這種情況下，需要進行多項研究來確定樣品基質干擾的原因。 使用實驗室制備的NOE儲存液提高了實驗室在短時間內進行多項研究的效率，并允許使用從5EU/mL到3500 EU/mL的加標濃度。表1-7顯示了一項使用不同測試樣本的研究數據，該樣本的 NOE加標非常低（5-40 EU/mL）。在這種情況下，測試樣本和無熱原水確認樣本的內毒素回收率是一致的，表明沒有基質干擾。

研究人員還使用了來自幾種不同生物的制備物，為收集到的數據增加了穩定性和可變性。這突出了使用內部NOE制備物的額外好處，因為來自多種生物的制劑可以在需要時快速制備和使用。

表1-8顯示了使用表1-5和表1-6中的相同測試樣本生成的部分數據，其中有來自高濃度EU/mL NOE生成物（粘質鏈霉菌）和低濃度EU/mL NOE生成物（A. 基因組）的加標。 兩者的目標濃度均為200 EU/mL，并顯示出相似的回收率，進一步表明測試樣品干擾了內毒素的回收，而不是任何檢測錯誤或特定內毒素來源的問題。

結論

本報告中提供的數據用于說明測試各種基質、溫度和儲存時間對在測試前將在實驗室中放置一段時間的樣品的內毒素回收的干擾的重要性。了解內毒素和樣品基質在起始時間點的相互作用尤為重要，因為此時可能存在的任何基質抑制都會被識別。在執行此測試或對在NOE被摻入測試樣品基質時表現出抑制的基質進行故障排除時，使用實驗室制備的NOE原液大大增加了可用的測試選項的靈活性、效率和范圍。當在起始時間點遇到基質抑制時，需要開發替代測試方法，在這種情況下NOE也非常有用，因為確認內毒素是否成功回收對于任何替代方法的實施都至關重要。